Diagnóstico laboratorial de cocos Gram-positivos
IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR
Primeiramente feio a coloração de Gram e dado positivo, a identificação dos estreptococos e estafilococos é baseada na morfologia que apresentam em meios líquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados. A identificação presuntiva começa com a inoculação primária na placa de ágar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tensão de CO² e os testes logo após.
PROVA DA CATALASE
A presença da catalase permite separar os estreptococos catalase negativa de outros cocos Gram-positivos produtores de catalase, por exemplo, estafilococos. A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. A liberação do oxigênio se observa pela formação de bolhas.
Colocar sobre uma lâmina uma gota de água oxigenada a 3%, com a alça bacteriológica coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se na lâmina de vidro e observar a formação de bolhas que indica positivo ou a não formação de bolhas que indica negativo. Em caso de dúvidas realizar o teste novamente.
IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS
O teste mais importante na identificação de Staphylococcus spp é a prova da catalase. Os estafilococos são divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase.
Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais freqüentes são:
- Staphylococcus aureus - freqüentemente está associado a infecções adquiridas na comunidade e no ambiente hospitalar. As infecções mais comuns envolvem a pele (celulite, impetigo) e feridas em sítios diversos.
- Staphylococcus epidermidis - causador de infecções de cateteres e próteses e o mais freqüente microrganismo encontrado em hemoculturas.
- Staphylococcus saprophyticus - causador de infecção urinária em mulheres jovens.
- Staphylococcus haemolyticus - importante devido à resistência aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemólise na placa de ágar sangue de carneiro.
TESTE DA COAGULASE EM LÂMINA
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) ligada na superfície da parede celular, que reagindo com o fibrinogênio do plasma, causa a coagulação do mesmo. Colocar 2 gotas de plasma de coelho em uma lâmina, escolher uma colônia e emulsionar no plasma. Se for positivo, Formação de grumos em 10 segundos. Formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus aureus. Não há formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus coagulase negativa.
TESTE DA COAGULASE EM TUBO
Este teste baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator plasmático formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio formando a fibrina. Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma de coelho, incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria, a formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. Qualquer coágulo indica uma prova positiva, porém não confundir com precipitados ou floculação.
TESTE DA DNASE
Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico (DNA). Fazer um inóculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio, incubar a 35±2ºC por 18 - 24 h. Formação de um claro ao redor do crescimento bacteriano. Formação de halo claro, identifica Staphylococcus aureus, crescimento sem formação de halo claro, identifica Staphylococcus coagulase negativa.
TESTE DO CRESCIMENTO EM ÁGAR MANITOL
O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de cloreto de sódio, denominado ágar manitol salgado ou Meio de Chapman. O indicador de pH é o vermelho de fenol, que indica uma reação positiva quando o meio ao redor das colônias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado.
TESTE DA RESISTÊNCIA A NOVOBIOCINA
A cepa é semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 µg. As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 12 mm, enquanto as susceptíveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus são resistentes.
IDENTIFICAÇÃO DOS ESTREPTOCOCOS
As bactérias do gênero Streptococcus são capazes de causar diversas doenças nos seres humanos. Dentre as mais freqüentes estão as infecções do trato respiratório, pele e tecidos moles, endocardites, sepse e meningites. Streptococcus pneumoniae, o pneumococo, é um dos agentes que mais freqüentemente causam doenças invasivas graves, como meningite e bacteremia. Os estreptococos, da família Streptococcaceae são caracterizados como cocos Gram-positivos, anaeróbios facultativos, não produtores de catalase e de citocromo-oxidase. Alfa-hemólise(α): é caracterizada por uma hemólise parcial, associada com a perda parcial de hemoglobina pelas hemácias, ocorrendo uma zona cinza-esverdeada no meio de cultura ao redor da colônia. Beta-hemólise(ß): é caracterizada pela lise completa das hemácias que rodeiam a colônia, ocorrendo uma zona transparente (zona de lise total) ao redor da colônia. Gama-hemólise(γ ): é caracterizada pela ausência de hemólise. Após o teste da catalase ter dado negativo, é visto o tipo da hemólise que a bactéria fez no Ágar-Sangue.
PROVA DA OPTOQUINA
A optoquina é uma droga solúvel em água que se difunde rapidamente em meio de cultura sólido. Semear uma suspensão de bactéria em uma placa de ágar sangue de carneiro 5% de forma a obter crescimento confluente, após a absorção da suspensão pelo meio de cultura, colocar um disco de optoquina na superfície do meio semeado, com o auxílio de uma pinça, incubar a 35±2ºC e 5 - 7% de CO2 por 18 - 24 h, fazer a leitura do halo de inibição do crescimento bacteriano. Presença de halo ≥ 14 mm indica que a cultura é sensível à optoquina, sendo identificado para Streptococcus pneumoniae .
TESTE DA SOLUBILIDADE EM BILE
Detergentes fracos, como os sais biliares desoxicolato de sódio ou taurocolato de sódio têm a capacidade de lisar seletivamente o S. pneumoniae em fase logarítmica do crescimento. Estes sais ativam as enzimas autolíticas (autolisinas) produzidas pelo pneumococo, acelerando a reação lítica natural da bactéria. O teste da bile-solubilidade pode ser realizado tanto em meio de cultura líquido como sólido. A turvação produzida por uma suspensão de pneumococo ficará completa ou parcialmente límpida ao se adicionar os sais biliares. Em meio sólido, as colônias bile-solúveis "desaparecem" em contato com algumas gotas de solução destes sais e o teste é um pouco mais difícil de ser visualizado. Separar dois tubos de ensaio com transparência adequada para observar a presença de suspensão bacteriana. Marcar um com "C" (tubo controle) e outro com "T" (tubo teste), adicionar solução de desoxicolato de sódio a 2% ao tubo "T" e solução salina a 0,85% ao tubo "C". Os volumes em cada tubo devem ser iguais, pequenos, mas suficientes para fazer a leitura, por exemplo, 0,5 mL. Adicionar a cada tubo o mesmo volume, por exemplo, 0,5 mL da suspensão bacteriana. Homogeneizar e fazer a leitura imediatamente, após 1 h e até 2 h de incubação a 35±2ºC. A leitura é feita de preferência contra um anteparo escuro, observando a turvação do tubo T em relação ao tubo C. Verificar se o tubo C apresenta uma suspensão homogênea da cultura em solução salina. Compará-lo com o conteúdo do tubo teste, contendo a cultura em desoxicolato de sódio. Se o tubo T apresentar turvação visivelmente menor que o controle ou estiver límpido, o teste é positivo e identifica Streptococcus pneumoniae, e confirma a positividade.
TESTE DO PYR
Este teste determina a atividade do PYR também chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e também pelo Enterococcus sp. Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou placa de Petri vazia, Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos intensa), Realizar um esfregaço com a bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o disco de PYR umidecido, Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorrerá em até 1 minuto. Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha, o aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo, S. pyogenes e Enterococcus spp. são PYR positivos.
- TESTE DA BACITRACINA
É importante notar que as identificações devem ser feitas em ágar sangue sem tensão de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes. Semear meia placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma; Colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; Incubar por uma noite a 35ºC sem CO2; Observar qualquer zona de inibição como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) é assim rapidamente identificado.
TESTE DE CAMP
Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo. As estrias não devem se tocar, ficando a 1 mm de distância, e deste modo várias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de ágar sangue. Incubar a placa a 35-37°C durante um período de 18-24 horas. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), é evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica, na área de intersecção entre as duas estrias.
IDENTIFICAÇÃO DOS ENTEROCOCOS
O diagnóstico do gênero Enterococcus spp., bem como das diferentes espécies, pode ser feito em diversos níveis de complexidade.
Apesar de não haver características fenotípicas que diferenciem totalmente o gênero Enterococcus de outros gêneros relacionados, a presença de cocos Gram-positivos dispostos aos pares ou em cadeias, catalase negativa com prova de PYR positiva, crescimento em caldo de NaCl a 6,5% e hidrólise da esculina são provas presentes na maioria das espécies do gênero Enterococcus. Com provas de PYR (Figura 6), hidrólise da esculina positiva (Figura 7) e crescimento em caldo de NaCl a 6,5% (Figura 8), são provas presentes na maioria das espécies do gênero Enterococcus.
ÁGAR BILE-ESCULINA
Esculina presente no meio é hidrolizada, formando esculetina e dextrose. A esculetina reage com sais de ferro presentes no meio tornando-o enegrecido. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. e Streptococcus bovis (Streptococcus do grupo D) de Streptococcus spp. Inoculam-se 2 a 3 colônias a serem testadas em base contendo bile-esculina, Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h. Presença de cor enegrecida no meio é indicativa da presença de hidrólise, isto é, uma prova positiva.
NACL 6,5%
Capacidade do microrganismo crescer em altas concentrações de sal. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. de Streptococcus spp. Inoculam-se 2 a 3 colônias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador) Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h. A turvação ou mudança de cor (no caso de adição de indicador) é indicativa de crescimento bacteriano.
Fontes:
- ANVISA. Serviço Saúde. Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. Disponível em : <https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_5_2004.pdf>. Acessado em : 01/05/2018.
- ANVISA. Serviço Saúde. Gram-positivos. Disponível em : <https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4/intr_sta.htm>. Acessado em : 01/05/2018.