Coloração de Gram
A coloração de Gram é o método tintorial predominante utilizado em bacteriologia. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram positivas, e as que ficavam vermelhas ou rosa, chamadas de Gram-negativas. Nas bactérias Gram positivas a parede celular é formada principalmente por ácidos teicóicos e nas bactérias Gram negativas, é formada principalmente por lipídeos. Por possuírem grande quantidade de peptidoglicano, após a coloração, as Gram positivas formam um complexo corado azul intenso, que não é removido facilmente com álcool-acetona. As Gram negativas não retêm a coloração após o tratamento com álcool-acetona e são reveladas posteriormente com solução de fucsina, apresentando-se na coloração avermelhada ou rosa. As gram-negativas possuem característica patológica, devido a substancia LPS. As gram-positivas possuem a característica de aderência, devido à exotoxina, composta pelo ácido lipoteinóico.
Os materiais utilizados são: Amostras de pacientes em placas já semeadas; Laminas; Alça bacteriológica; Pipeta de Pasteur; Papel toalha; Solução salina; Cristal Violeta; Lugol; Álcool-Acetona (descorante); Fucsina; Lamparina.
A metodologia é da seguinte forma:
Esfregaço
- Pegar uma lâmina.
- Colocar na lâmina uma gota de solução salina fisiológica.
- Flambar a alça bacteriológica, deixar esfriar próximo a chama, abrir a placa com a cultura teste e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra.
- Esfregar o material em movimentos de rotação com a alça bacteriológica, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme.
- Flambar a alça bacteriológica novamente para esterilizar.
- Fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na chama da lamparina (rapidamente).
- Após a secagem, identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço.
Coloração de Gram
- Cubra o esfregaço com violeta-de-cristal e deixe por 1 minuto.
- Escorra o violeta-de-metila e lave em um filete de água corrente.
- Cubra a lâmina com lugol(iodo) e deixe agir por 1 minuto.
- Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente.
- Adicione álcool etílico sobre a lâmina, descorando-a, até que não desprenda mais corante.
- Lave em um filete de água corrente.
- Cubra a lâmina com fucsina(safranina) e deixe agir por aproximadamente 40 segundos.
- Lave em um filete de água corrente.
- Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo.
- Após a secagem, coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço.
- Leve ao microscópio para ser observado na objetiva de imersão (100 X).
Referências:
https://www.klimanaturali.org/2011/02/bacterias-gram-positivas-e-gram.html
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf